雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)分类学上属于绿藻门(Chlorophata)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococcaceae)、红球藻属(Haematococcus,Ag.)( Goodwin and Jamikom, 1954; Droop, 1955)。它在强光、高盐和缺氮等胁迫条件大量合成虾青素，因而成为研究微藻胁迫生物学和基因调控机理的理想材料(Kobayashi et al., 2001)。虾青素在雨生红球藻中的生物合成途径已经基本清楚(Cunningham and Gantt, 1998; Grunewald et al., 2001)，它由丙酮酸盐和3-磷酸甘油醛合成异戊烯焦磷酸(IPP)开始，经过多步反应，最后在β-胡萝卜素酮化酶(BKT或CRTO)和β-胡萝卜素羟化酶(CRTR-B或CRTZ)作用下合成虾青素(Misawa et al., 1995; Lotan and Hirschberg, 1995)。目前，对其合成酶基因转录调控的研究尚浅，该研究的关键是获得它们的启动子并对其功能进行深入分析。但是，由于雨生红球藻存在的基因多拷贝现象，通过PCR获得的启动子序列往往信息不准确，序列不完整，妨碍我们深入、全面的对上游调控序列进行研究。秦松等利用基因组步移技术分离到两个bkt的5′侧翼上游序列(Meng et al., 2005; 魏炜等, 2006)和一个crtR-B的5′侧翼序列(Meng et al., 2006)，长度分别为795 bp、695 bp和302 bp。运用基因组步移法，crtO基因的3段5′非翻译区被克隆出来，利用PlantCARE数据库进行分析，ABRE、C-repeat/DRE、G-box和MBS等调控元件都被发现，显示它们与多种胁迫都有关联(高政权等, 2010)。完整的基因上游调控序列将包括更多的基因调控信息，而构建基因组文库是最好的选择。

基因组文库是通过分子生物学手段将生物基因组DNA分成不同大小的片段，然后连接到某些特定的载体，转化到宿主菌中，最后形成基因组文库。所以，基因组文库含生物全部的遗传信息，由含有基因信息的随机片段所组成,完整的基因组文库使任何基因的筛选和获得成为可能(王宁等, 2005)。它的容量与构建文库所用到的克隆载体有很大的关系，一般包括质粒、噬菌体、粘粒，更大容量的克隆载体则要选择人工染色体(张平武等, 2000; 陈献伟等, 2010)。在构建基因组文库时，合适的基因组DNA片段的获得也很重要，一般通过限制性内切酶或超声波等生物、物理方法对基因组DNA进行降解，再通过琼脂糖凝胶电泳分离、纯化。获得尽可能长的基因组片段将最大限度地保存基因信息，尤其是上游调控序列，这对研究基因调控、发掘高效启动子具有重要意义。通过限制性内切酶 Sau3AⅠ对杜氏盐藻基因组DNA进行部分酶切，构建了平均长度12.6 kb的杜氏盐藻基因组文库(王宁等, 2005)。通过剪切仪随机断裂小麦基因组DNA，可以构建BAC shotgun文库(张俊成等, 2007)。本研究以雨生红球藻31-1n为材料，构建了雨生红球藻基因组文库，并从中获得完整的β-胡萝卜素酮化酶基因，该工作将为我们研究虾青素合成酶基因上游调控序列的功能奠定基础。

1 结果与分析

1.1 雨生红球藻34-1n基因组DNA的提取及酶切分析

构建基因组文库中重要的一步就是获得高质量的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分析显示，DNA条带清晰无降解，利用蛋白酶K处理细胞后，获得的基因组DNA量也较大，每管可获得50 μg基因组DNA(图1)。分光光度计紫外光吸收值结果显示，所提取基因组DNA的A260/A280介于1.8~1.92之间，A260/A230介于2.4~2.56之间，DNA的蛋白含量和盐离子含量均在允许范围内，说明所提取的DNA符合建库标准。

为最大限度地获得能克隆入质粒中的DNA片段，需要对酶切条件进行摸索。Sau3AⅠ对基因组DNA的降解能力很强，通过对酶浓度和酶切时间的优化可以获得尽可能多的6-8 kb 基因组DNA片段，获得的片段也具有与BamHⅠ酶切相同的末端，方便它们与载体连接。Sau3AⅠ的酶切分析结果显示：最适限制性内切酶浓度为0.025 U/μL，37℃、30min，可以获得用于建库的6-8kb片段(见图2)。

1.2 基因组文库的构建

需要回收的DNA片段为6-8 kb，通过低熔点琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收试剂盒回收，结果如图3。因为目的DNA的浓度直接影响到连接反应的效果，而回收后目的片段浓度较低，可通过DNA干燥仪进一步浓缩，最终达到200 ng/μL，去盐处理也可以大大提高基因组片段的连接效率。

Sau3AⅠ与BamHⅠ为同尾酶，获得的酶解片段均含有5′-CTAGA-3′,经T4连接酶可以直接将基因组片段插入到pUC18的BamHⅠ位点。电击转化时要控制好电压强度和电击时间，减轻对转化细胞的损害，甘露醇的加入可以保护细胞，提高转化效率。

1.3 雨生红球藻基因组文库的鉴定

基因组文库稀释后在含IPTG和X-gal的LB平板上铺菌，进行蓝白斑筛选，蓝斑少于10%。随机挑取28个白斑及4个蓝斑菌落，提取质粒进行电泳分析，如图4所示。

从电泳图可见，白斑的质粒插入片段大小为6~8 kb，且超过80℅的克隆子的插入片段均为6~8 kb，平均插入长度约为6.5 kb。实验共获得200 μL文库，取1 μL稀释100倍铺板，获得了30个单克隆，据此计算出总克隆数约为6×10⁵个，符合基因组文库构建的要求，显示本实验获得了较为完整的雨生红球藻基因组文库。

1.4 雨生红球藻bkt1基因组序列的获得

利用引物crtO-3和crtO-4由基因组文库扩增得到bkt1的基因组序列(1 020 bp)(见图5)，最终筛选到单克隆，送华大基因测序。测序结果表明：获得的bkt1基因组序列长度为2 129 bp，提交NCBI并与crtO (GenBank:DQ086233.1)的序列进行比对，结果显示该片段与crtO基因组序列具有93%的同源性，该序列含有6个外显子，分别为16~402 bp、527~657 bp、861~949 bp、1310~1458 bp、1746~1879 bp和2031~2120 bp，其余则为内含子序列(见图6)。

2 讨论

基因组文库(genomic 1ibrary)是基因工程中重要的研究手段，它通常含有生物体完整的基因组遗传信息，以不同大小的片段存储于特定的基因工程载体。这种保存基因组遗传信息的材料，就称为。目前构建基因组DNA文库通常采用λ噬菌体载体、粘粒载体(Meyerowitz et al., 1980)和酵母人工染色体载体(Bancroft et al., 1997)。基因组文库包含了完整的基因组信息，所以构建时使用的基因组DNA必须是完整且没有受到污染的 (徐志祥等, 2004; 马永红等, 2005)。基因组文库的构建过程实际上就是把不同大小的基因片段插入载体中，因此连接实验关乎着文库构建的成功率，需要关注插入片段、载体和感受态细胞的质量，如果要避免自连，还可以加入碱性磷酸。本实验中，我们探索了不同的插入片段和载体比例，结果发现3:1的摩尔比是最好的。该论文所构建的雨生红球藻基因组文库的插入片段80%以上都是6~8 kb，获得的克隆数目约为6×10⁵个，按照插入片度平均长度6.5 kb计算，基因组文库可覆盖雨生红球藻基因组(按莱茵衣藻1×10⁸ bp计算)约39倍，是文献报道的微囊藻基因组文库的3.9倍，也比它500 bp的平均插入片段长，可以包含更完整的基因信息(周晓明等, 2001)。王宁等构建的杜氏盐藻基因组文库采用λDNA作为载体，插入片段的平均长度达到12.6 kb。

Bkt1基因是雨生红球藻虾青素合成过程中的关键酶基因，本实验利用已知序列设计引物，筛选构建好的基因组文库，可以从中获得含有该序列的单克隆，通过测序可以获得它的基因组序列，进行生物信息学分析可以获得其内含子、外显子等信息，它的启动子和终止子序列也被分离出来，进行启动子调控元件的分析。GeneTool软件分析结果显示，bkt1基因序列中各核苷酸含量分别为：A 309(21.6%)，C 412(28.9%)，G 366(25.6%)，T 341(23.9%)，GC含量高于AT含量，密码子的第三位碱基也偏好GC，这与衣藻的研究结果一致(Rochaix, 2001)。

3材料与方法

3.1 材料与试剂

雨生红球藻34-1n购自德国The Culture Collection of the University of Göttingen。大肠杆菌DH5a、TOP10菌株为本实验室保存。质粒pUC18，限制性内切酶BamHⅠ和Sau3AⅠ,LA Taq聚合酶、T4连接酶、Wide Range DNA Marker (500-12000)、质粒提取试剂盒、PCR反应试剂盒均购自TaKaRa 生物工程(大连)有限公司。DNA提取试剂盒购自晶美公司。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。酚氯仿、无水乙醇等生化试剂，均为分析纯。

3.2 雨生红球藻培养于液体BBM培养基中，22℃，20 μE·m^-2·s^-1连续光照条件下培养，取游动的绿色细胞作为构建基因组文库的材料。

3.3 基因组 DNA的提取 雨生红球藻基因组DNA的提取采用QIAGEN® Puregene Tissue Core Kit A。取20 mL对数生长期的雨生红球藻培养液于4℃ 条件8 000 g 离心3~5 min,去上清。加990 μL裂解液重悬,再加4.96 μL蛋白酶K混匀，转移到1.5 mL的离心管，55℃温浴90 min，直至变褐色。冷却至室温加330 μL蛋白沉淀剂，上下颠倒150次，冰浴15 min，然后13 000 g离心5 min，取上清，加等体积的酚氯仿抽提1~3次。加2倍体积无水乙醇摇匀沉淀DNA，-20℃放置20 min。然后4 ℃条件13 000 g离心5 min，去上清，加500 μL 70%乙醇洗涤一次，沉淀溶于25 μL去离子水中，取1~2 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测其浓度。

3.4 基因组DNA的酶切分析 先用去离子水将Sau3AⅠ的酶浓度分别稀释为0.05 U/μL、0.03 U/μL、0.025 U/μL和0.02 U/μL。在20 μL的限制性内切酶反应体系中加入2 μL基因组DNA，再分别加入以上各浓度的酶稀释液1 μL。在37℃分别进行限制性内切酶消化30 min和60 min，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，以选取合适的限制性内切酶消化条件。

3.5 6-8kb基因组 DNA片段的获得 取4 μg雨生红球藻基因组DNA，加入Sau3AⅠ进行酶切，37℃酶切30 min。酶切体系如表1。

3.6 目的片段的分离、纯化及测定

通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收6-8kb之间的DNA片段，通过胶回收试剂盒回收DNA片段，作为文库构建的插入片段。核酸浓度及纯度的测定采紫外分光光度计，根据A260/280的比值来判断。

3.7 pUC18质粒载体的制备

参照质粒提取试剂盒提取质粒pUC18。质粒经BamHⅠ酶切，用碱性磷酸酶对其进行去磷酸化，再通过1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，切胶回收载体作为构建文库的质粒载体。

3.8 雨生红球藻基因组文库的构建

基因组文库的构建主要包括以下几个步骤。(1)片段连接：取100~300 ng雨生红球藻6-8 kb的基因组DNA片段，与30 ng的pUC18载体连接。(2)连接产物的除盐处理。(3)连接产物的转化采用电转化，按照以下步骤操作：以E.coli DH5a作为受体细胞，吸取2 μL脱盐后连接产物，加入30-100 μL感受态细胞中进行电转化， 0.1 cm²的电击杯在电压为2.1 kV的条件下进行电转化，然后加入900 μL的SOC液体培养基，37℃摇床上复苏45~60 min，然后将100 μL细胞涂布到含有Amp、X-gal、IPTG的LB平板上，37℃培养16~24 h。

3.9 雨生红球藻34-1n基因组文库的检测

用无菌牙签随机挑取28个白斑及4个蓝斑，培养于LB培养液中并提取质粒进行限制性内切酶酶切验证，分析插入片段的长度。

3.2.9 bkt1基因组序列的扩增

根据34-1n β-胡萝卜素加氧酶基因cDNA序列(Genbank登录号: DQ257290.1)设计PCR引物，引物为crtO-3 (5' TATCACATGCCATCCGAGTC 3')和crtO-4 (5'  GCAGGTAAGTGCCGAAGTAGA 3')，对雨生红球藻的基因组文库进行PCR筛选，PCR程序为：95℃变性5 min；95℃，3 min，50℃，1 min，72℃，1 min，5个循环；94℃，3 min，52℃，1 min，72℃，1 min，30个循环；72℃延伸10 min。获得含bkt1的克隆，并对其序列进行分析。

作者贡献

王潮岗为本实验的主要设计和完成人，负责雨生红球藻的培养、基因组DNA的提取和文库构建等工作。张雪芹协助完成了文库构建的部分工作，以及bkt1生物信息学的分析。胡章立对该实验和论文撰写进行了指导。

致谢

感谢赵昌南为本实验做的基础性工作，感谢国家自然科学基金项目(31000162和31070323)的资助。

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